«Գրանցված է»

ՀՀ արդարադատության

նախարարության կողմից

ՀԱՅԱՍՏԱՆԻ ՀԱՆՐԱՊԵՏՈՒԹՅԱՆ

ԱՌՈՂՋԱՊԱՀՈՒԹՅԱՆ ՆԱԽԱՐԱՐ

20 մարտի 2008 թ. ք. Երևան

N 06-Ն

Հ Ր Ա Մ Ա Ն

«ՊԱՐԵՆԱՅԻՆ ՀՈՒՄՔՈՒՄ ԵՎ ՍՆՆԴԱՄԹԵՐՔՈՒՄ ԶԵԱՐԱԼԵՆՈՆԻ ՊԱՐՈՒՆԱԿՈՒԹՅԱՆ ՈՐՈՇՄԱՆ ՄԵԹՈԴ»-Ը ՀԱՍՏԱՏԵԼՈՒ ՄԱՍԻՆ

Համաձայն «Հայաստանի Հանրապետության բնակչության սանիտարահամաճարակային անվտանգության ապահովման մասին» Հայաստանի Հանրապետության օրենքի 4-րդ հոդվածի, Հայաստանի Հանրապետության կառավարության 2002 թվականի օգոստոսի 15-ի «Հայաստանի Հանրապետության առողջապահության նախարարության պետական հիգիենիկ և հակահամաճարակային ծառայությունը և դրա ենթակայության մարմինները վերակազմակերպելու և Հայաստանի Հանրապետության պետական հիգիենիկ և հակահամաճարակային տեսչության կանոնադրությունն ու կառուցվածքը հաստատելու մասին» N 1316-Ն որոշմամբ հաստատված Հայաստանի Հանրապետության առողջապահության նախարարության պետական հիգիենիկ և հակահամաճարակային տեսչության կանոնադրության 7-րդ կետի «ե» ենթակետի՝ ելնելով բնակչության առողջության պահպանման շահերից՝ պարենային հումքում և սննդամթերքում զեարալենոնի պարունակության որոշման մեթոդը սահմանելու նպատակով,

Հաստատել` «Պարենային հումքում և սննդամթերքում զեարալենոնի պարունակության որոշման մեթոդը» (կցվում է):

Նախարար՝

Հ. Քուշկյան

Հավելված ՀՀ առողջապահության նախարարի 2008 թվականի մարտի 20-ի N 06-Ն հրամանի

Մ Ե Թ Ո Դ

ՊԱՐԵՆԱՅԻՆ ՀՈՒՄՔՈՒՄ ԵՎ ՍՆՆԴԱՄԹԵՐՔՈՒՄ ԶԵԱՐԱԼԵՆՈՆԻ ՊԱՐՈՒՆԱԿՈՒԹՅԱՆ ՈՐՈՇՄԱՆ

1. Կիրառման ոլորտը

Սույն մեթոդով սահմանվում է պարենային հումքում և սննդամթերքում զեարալենոնի պարունակության որոշումը նրբաշերտ քրոմատագրաֆիկ և բարձր էֆեկտիվության հեղուկային քրոմատագրման միջոցով:

2. Սարքավորումներ եվ նյութեր

2.1 Նմուշի թափահարման սարք:

2.2 Ռոտացիոն գոլորշացուցիչ:

2.3 Լաբորատոր էլեկտրաաղաց:

2.4 Լուծույթում վիտամինների հայտնաբերման ֆլուորեսցենտային սարք, կամ ախտորոշման լամպ, կամ լյումինասկոպ:

2.5 Հեղուկային քրոմատագրման ալիքի փոփոխական երկարությամբ ուլտրամանուշակագույն դետեկտորով (կամ ֆլուորիմետրիկ դետեկտորով) սիլիկագելով աշտարակ և նախաշտարակ, մասնիկների չափերը` 5 մկմ, աշտարակի երկարությունը` 25 սմ, նախաշտարակի երկարությունը` 4,5 սմ, ներքին տրամագիծը` 4,6 մմ:

2.6 Միկրոներարկիչներ 5 մկլ և 10 մկլ:

2.7 ՆՇՔ-ի համար հերմետիկ փակվող ապակյա խցիկներ:

2.8 ՆՇՔ-ի համար թիթեղներ` 15 x15 սմ կամ 20 x 20 սմ չափսերով:

2.9 Հարթահատակ 250 մլ կոնաձև կոլբեր:

2.10 Տանձաձև 100 մլ-նոց կոլբեր:

2.11 Տանձաձև 10-20 մլ-նոց կոլբեր:

2.12 Չափիչ 100 մլ-նոց կոլբեր:

2.13 Չափիչ 100 մլ-նոց գլաններ, հերմետիկ փակվող խցանով:

2.14 Բաժանիչ ձագարներ:

2.15 Քրոմատագրման ապակյա աշտարակ, 220 մմ x 15 մմ:

2.16 Տանձիկով ապակյա հեղուկացրիչ:

2.17 Զեարալենոնի ստուգիչ (ստանդարտ) լուծույթ` 10 մգ/մկլ բենզոլային լուծույթ:

2.18 Ացետոնիտրիլ:

2.19 Ացետոն, «մհհ»:

2.20 Բենզոլ, «մհհ»:

2.21 Հեքսան, «մ» կամ հեպտան, «մհհ»:

2.22 Էթանոլ:

2.23 Աղաթթվական ալյումին 6-ջրով, «մհհ»:

2.24 Ծծմբաթթվական նատրիում անջուր, «մհհ»:

2.25 Նատրիումի հիդրոկարբոնատ, «մհհ»:

2.26 Աղաթթվական նատրիում, «քմ»:

2.27 Մրջնաթթու, «մ»:

2.28 Կայուն կապույտ B-աղ (դիազոլ կապույտ C) կամ կայուն մանուշակագույն B-աղ. հյուսվածքաբանության համար:

2.29 Ակտիվացված ածուխ:

2.30 Եթեր, բժշկական:

Սույն մեթոդում կիրառվում են հետևյալ հապավումները`

«մհհ»` մաքուր հետազոտության համար,

«մ»` մաքուր,

«քմ»` քիմիապես մաքուր,

ՆՇՔ` նրբաշերտ քրոմատագրում,

Rf` նյութի ճակատի (մեկնարկի գծից մինչև բծի կենտրոն) հարաբերությունը լուծիչների ճակատին (մեկնարկի գծից մինչև լուծիչների ճակատի գիծը),

ԲԷՀՔ` բարձր էֆեկտիվության հեղուկային քրոմատագրման սարք:

Օգտագործվող չափման միջոցները, սարքավորումները, քիմիական նյութերը իրենց չափագրական բնութագրերով պետք է ապահովեն մեթոդի ճշտության աստիճանը:

3. Լուծամզում

Հետազոտվող նմուշը 1-2 րոպեում մանրացնում են լաբորատոր աղացով կամ սրճաղացով: Մանրացված ցորենից կամ ալյուրից 25 գ լցնում են 250 մլ-ոց կոնաձև, հարթահատակ կոլբի մեջ, ավելացնում են 20 մլ թորած ջուր, հետո` 105 մլ ացետոնիտրիլ: Թափահարման սարքի վրա թափահարում են 30 րոպեի ընթացքում: Ստացված խառնուրդը ֆիլտրում են ծալքերով ֆիլտրե թղթով` չափիչ գլանի մեջ: Զեարալենոնի հետազոտության համար վերցնում են 50 մլ լուծամզուկ:

4. Զեարալենոնի պարունակության հայտնաբերումը, նույնացումը եվ հաշվարկումը

4.1 Լուծամզուկի մաքրումը.

500 մլ-ոց բաժանիչ ձագարի մեջ լցնում են 50 մլ ֆիլտրատ, ավելացնում 50 մլ հեքսան (կամ հեպտան)` հագեցված ացետոնիտրիլով (500 մլ-ոց կոնաձև սրվակի մեջ լցնում են 200 մլ հեքսան և 30 մլ ացետոնիտրիլ, արագ կերպով թափահարում են և շերտավորումից հետո վերցնում են վերևի հեքսանային շերտը) և թափահարում: Շերտերի բաժանվելուց հետո, վերևի հեքսանային շերտը թափվում է: Ներքևի ացետոնիտրիլային շերտը երկու անգամ թափահարում են 30-ական մլ հեքսանով հագեցված ացետոնիտրիլով, ամեն անգամ թափելով վերևի հեքսանային շերտը: Բաժանիչ ձագարի մեջ գտնվող յուղազրկված ացետոնիտրիլի մզուկի վրա ավելացնում են 100 մլ թորած ջուր և 50 մլ բենզոլ: Թափահարում են և շերտավորումից հետո առանձնացնում վերևի բենզոլային շերտը: Եթե շերտավորումը լավ չի կատարվում, ավելացնում են 10 մլ նատրիումի քլորիդի հագեցած լուծույթ և խառնուրդը նորից թափահարում: Ջրային շերտը կրկնակի անգամ մաքրում են 30-ական մլ բենզոլով: Բենզոլային շերտերը միացնում և չորացնում են անջուր ծծմբաթթվային նատրիումով, որից հետո ֆիլտրում են 100 մլ-ոց տանձաձև կոլբի մեջ և գոլորշացնում են ռոտացիոն գոլորշացուցչի վրա 45⁰C-ից ոչ ավելի ջերմաստիճանում: Ծծմբաթթվական նատրիումը լվանում են 10 մլ բենզոլով: Լվացուկը ֆիլտրելով ավելացնում են նույն տանձաձև կոլբի մեջ և գոլորշացնում մինչև վերջ: Մնացորդը լուծում են 500 մկլ բենզոլի մե (լուծույթ 1):

4.2 Զեարալենոնի հայտնաբերումը և հաստատումը ՆՇՔ-ի օգնությամբ.

«Սիլուֆոլի» թիթեղի ներքևի եզրից 12 մմ բարձրության վրա նշում են բարակ մատիտով, որի վրա, իրարից 2 սմ հեռավորության վրա, միկրոներարկիչի օգնությամբ կաթեցնում են 5 և 10 մկլ լուծույթ 1-ից: 5 և 10 մկլ հետքերի արանքում, 1-ական սմ հեռավորության վրա, կաթեցնում են 5, 10 և 20 մկլ զեարալենոնի ստանդարտ լուծույթ (համապատասխանաբար 50, 10, 20 նգ): Նմանապես պատրաստում են «Սիլուֆոլի» 2-րդ թիթեղը: Երկու թիթեղներն էլ տեղավորում են ՆՇՔ-ի ապակյա խցիկի մեջ, որի մեջ լցված է հեքսան-ացետոն (7:3 հարաբերությամբ) լուծույթ: Երբ լուծիչների եզրագիծը հասնում է թիթեղի վրա նշված վերևի գծին (վերևի եզրից 3 սմ ներքև), թիթեղները հանում են և 2-3 րոպե չորացնում օդում:

Զեարալենոնի հայտնաբերման համար 1-ին թիթեղը հեղուկացրիչի օգնությամբ մշակում են ալյումինի քլորիդի 10%-ոց սպիրտային լուծույթով: Թիթեղը չորացնում են չորացնող պահարանում 10 րոպե 100-105⁰C ջերմաստիճանում: Եթե թիթեղի վրա նմուշի հայտնաբերված հետքը իր ֆլուորեսցենցիայի գույնով (կապույտ) համընկնում է զեարալենոնի ստանդարտ լուծույթի հետքի գույնի հետ, ապա դա վկայում է նմուշի մեջ զեարալենոնի առկայությունը:

Զեարալենոնի առկայության հաստատման համար 2-րդ ՆՇՔ թիթեղը հեղուկացրիչի օգնությամբ մշակում են կայուն կապույտ «B»-աղի 1%-նոց լուծույթով կամ կայուն մանուշակագույն «B»-աղի 1%-նոց ջրային լուծույթով, հետո` անմիջապես ածխաթթվական նատրիումի 5% լուծույթով` մինչև զեարալենոնի ստանդարտ հետքի մուգ կարմիր երանգի հայտնվելը:

Նմուշի մեջ զեարալենոնի առկայությունը հաստատվում է, եթե թիթեղի վրա հայտնաբերված հետքերը գույնով և քրոմատագրման շարժողականությամբ (Rf) համապատասխանում են զեարալենոնի ստանդարտին:

4.3 Երկչափ ՆՇՔ-ի օգնությամբ զեարալենոնի քանակական հայտնաբերումը.

ՆՇՔ թիթեղի վրա մատիտով նշում են բարակ գիծ, չվնասելով սիլիկագելի շերտը: Ներքևի աջ անկյունում, եզրից 12 մմ հեռավորության վրա միկրոկաթոցիկի օգնությամբ, քրոմատագրման թիթեղի վրա կաթեցնում են 20 մկլ լուծույթ 1-ից: Քրոմատագրման թիթեղի վերևի աջ անկյունում միկրոկաթոցիկի օգնությամբ կաթեցնում են 3 և 7 մկլ զեարալենոնի ստանդարտ լուծույթից, 10 և 20 մկլ լուծույթ 1-ից, ներքևի ձախ անկյունում կաթեցնում են 5 և 10 մկլ զեարալենոնի ստանդարտ լուծույթից, 2 և 5 մկլ լուծույթ 1-ից: Թիթեղը տեդադրում են քրոմատագրման խցիկի մեջ, որտեղ լցված է հեքսան-ացետոն (7:3 հարաբերությամբ) խառնուրդը և քրոմատագրում են առաջին ուղղությամբ մինչև հեղուկի եզրագծին հասնելը (որը նախօրոք նշված էր թիթեղի վերևի եզրից 4,5 սմ հեռավորության վրա), այնուհետև թիթեղը հանում են խցիկից և 5 րոպե չորացնում օդում: Հետո թիթեղը տեղադրում են քրոմատագրման խցիկի մեջ, որտեղ լցված է շարժուն ֆազը` տոլուոլ-էթիլացետատ-քլորոֆորմ 85% մրջնաթթու (45:25:25:5 հարաբերությամբ) և քրոմատագրում են 2-րդ ուղղությամբ մինչև հեղուկի եզրագծին հասնելը (որը նույնպես նշված էր թիթեղի վերին եզրից 4,5 սմ հեռավորության վրա): Թիթեղը հանում են խցիկից, չորացնում և հայտածում են ալյումինի քլորիդի (AlCL₃) 10% սպիրտային լուծույթով, որից հետո շարունակում են ինչպես 4.2 կետում: Համեմատելով զեարալենոնի ստանդարտ լուծույթի տարբեր կոնցենտրացիաների հետքերի գույների ինտենսիվությունը նմուշի (լուծույթ 1) հետքի գույնի ինտենսիվության հետ, որոշում են զեարալենոնի քանակը (նգ) մզուկի մեջ: Նմուշի մեջ զեարալենոնի քանակը հաշվում են հետևյալ բանաձևով.

C

=

V1 × V3 × m V2 × V4 × M × 1000

(մգ/կգ)

որտեղ`

C- զեարալենոնի քանակն է նմուշում, մգ/կգ,

V1 -լուծամզման համար վերցված ջուր -ացետոնիտրիլ խառնուրդի ծավալն է (125 մլ),

V2 - հետազոտության համար վերցված ջուր-ացետոնիտրիլ խառնուրդի ծավալն է (50 մլ),

V3 - ՆՇՔ-ից առաջ մաքրված լուծամզուկի (լուծույթ 1) ծավալն է (500 մկլ),

V4 - թիթեղի վրա կաթեցվող մաքուր լուծամզուկի (լուծույթ 1) ծավալն է (20 մկլ),

M - անալիզի համար վերցված նմուշի կշիռն է (25 գ),

m-V4 մկլ մաքրված լուծամզուկի մեջ զեարալենոնի հայտնաբերված քանակն է (նգ):

Հաշվի առնելով փակագծերում նշված ծավալները և կշիռները` բանաձևը կարտահայտվի հետևյալ ձևով`

C= 0.0025.m մգ/կգ

Եթե նմուշի մեջ հայտնաբերված զեարալենոնի հետքերի գույնի հագեցվածությունը գերազանցում է ստանդարտ լուծույթի հետքերի գույնի հագեցվածությանը` համապատասխանող 20 մկլ ստանդարտ լուծույթին (200 նգ զեարալենոն), ապա քրոմատագրման թիթեղի վրա կաթեցնում են կամ լուծամզուկի քիչ քանակություն (փոքրացնել V<sub>4</sub>  ծավալը ), կամ էլ` լուծույթ 1-ը նոսրացնում են բենզոլով (մեծացնել V₃  ծավալը)` հաշվարկային բանաձևի մեջ կատարելով համապատասխան ճշգրտումներ:

4.4 Զեարալենոնի հայտնաբերման և քանակական որոշման բարձր էֆեկտիվության հեղուկային քրոմատագրման (ԲԷՀՔ) եղանակը.

ԲԷՀՔ-ի պայմանները. շարժուն ֆազը` հեքսան-դիէթիլեթեր-քացախաթթու (65:35:1 հարաբերությամբ) արագությունը` 1,5 մլ/րոպե կամ պետրոլեային եթեր (եռման աստիճանը 40-70⁰C) -դիէթիլեթեր-քացախաթթու (50:50:1 հարաբերությամբ) արագությունը` 2 մլ/րոպե: Խորհուրդ է տրվում պետրոլեային եթերը և հեքսանը օգտագործել թորելուց հետո, եթերը օգտագործել ալյումինի օքսիդի 5 սմ շերտով ֆիլտրելուց հետո: Ուլտրամանուշակագույն դետեկտոր` ալիքի երկարությունը 283 նմ, զգայունությունը` սանդղակի 0,005 օպտիկական խտության միավոր (Օ.Խ.Մ), ինքնագրիչի սանդղակը` 10 մՎ: Ֆլյուորոմետրիկ դետեկտորը օգտագործելու դեպքում գրգռման գծի վրա ալիքի երկարությունը դրվում է մոտավորապես 283 նմ, իսկ էմիսսիայի գծի վրա ֆիլտրը` սկսած 420 նմ-ից (մոնոքրոմատորի դեպքում` 440 նմ):

Սարքի սանդղավորման համար միկրոներարկիչի օգնությամբ ներարկում են 2 և 5 մկլ ստանդարտ լուծույթ, որը համապատասխանում է 20 և 50 նգ զեարալենոնի պարունակությանը: Ստանդարտ լուծույթի ամեն մի քանակի համար քրոմատագրամի վրա հաշվում են պիկի բարձրությունը: Պիկի դուրս գալու ժամանակը կազմում է 5-7 րոպե:

Քրոմատագրաֆ են ներարկում 10 մկլ լուծույթ 1-ից: Զեարալենոնի քանակը հաշվարկում են համեմատելով նմուշի և ստանդարտի պիկերի դուրս գալու ժամանակը և բարձրությունը (մմ): Զեարալենոնի խտությունը հաշվում են հետևյալ բանաձևով`

C

=

V1 × V3 × m × h1            V2 × V4 × M × h2 × 1000

(մգ/կգ)

որտեղ`

C` զեարալենոնի քանակը նմուշում, մգ/կգ,

V1` ջուր -ացետոնիտրիլ խառնուրդի քանակը, մլ (125),

V2` անալիզի համար վերցված ջուր-ացետոնիտրիլ խառնուրդի ծավալը մլ-ով (50 մլ),

V3` ԲԷՀԳՔ-ից առաջ մաքրված լուծամզուկի ծավալը (լուծույթ 1) մկլ-ով (500 մկլ),

V4` մաքրված լուծամզուկի (լուծույթ 1) ծավալը մկլ-ով (20 մկլ),

M` անալիզի համար վերցված նմուշի կշիռը (25 գ),

m` ԲԷՀՔ ներարկվող զեարալենոնի ստանդարտի քանակը (նգ),

h1` ստանդարտ պիկի բարձրությունը մմ-ով,

h2` նմուշի մեջ հայտնաբերված զեարալենոնի պիկի բարձրությունը մմ-ով:

Եթե զեարալենոնի պիկի բարձրությունը դուրս է գալիս սանդղակի սահմաններից, ապա անալիզը կրկնում են վերցնելով (V₃) լուծույթի ավելի փոքր ծավալ: