«Գրանցված է»

ՀՀ արդարադատության

նախարարության կողմից

ՀԱՅԱՍՏԱՆԻ ՀԱՆՐԱՊԵՏՈՒԹՅԱՆ

ԱՌՈՂՋԱՊԱՀՈՒԹՅԱՆ ՆԱԽԱՐԱՐ

20 մարտի 2008 թ. ք. Երևան

N 07-Ն

Հ Ր Ա Մ Ա Ն

«ՊԱՐԵՆԱՅԻՆ ՀՈՒՄՔՈՒՄ ԵՎ ՍՆՆԴԱՄԹԵՐՔՈՒՄ N-ՆԻՏՐՈԶԱՄԻՆՆԵՐԻ ՊԱՐՈՒՆԱԿՈՒԹՅԱՆ ՈՐՈՇՄԱՆ ՄԵԹՈԴ»-Ը ՀԱՍՏԱՏԵԼՈՒ ՄԱՍԻՆ

Համաձայն «Հայաստանի Հանրապետության բնակչության սանիտարահամաճարակային անվտանգության ապահովման մասին» Հայաստանի Հանրապետության օրենքի 4-րդ հոդվածի, Հայաստանի Հանրապետության կառավարության 2002 թվականի օգոստոսի 15-ի «Հայաստանի Հանրապետության առողջապահության նախարարության պետական հիգիենիկ և հակահամաճարակային ծառայությունը և դրա ենթակայության մարմինները վերակազմակերպելու և Հայաստանի Հանրապետության պետական հիգիենիկ և հակահամաճարակային տեսչության կանոնադրությունն ու կառուցվածքը հաստատելու մասին» N 1316-Ն որոշմամբ հաստատված Հայաստանի Հանրապետության առողջապահության նախարարության պետական հիգիենիկ և հակահամաճարակային տեսչության կանոնադրության 7-րդ կետի «ե» ենթակետի՝ ելնելով բնակչության առողջության պահպանման շահերից՝ պարենային հումքում և սննդամթերքում ցնդող N-նիտրոզամինների պարունակության որոշման մեթոդը սահմանելու նպատակով,

Հրամայում եմ`

Հաստատել «Պարենային հումքում և սննդամթերքում ցնդող N-նիտրոզամինների պարունակության որոշման մեթոդը» (կցվում է):

Նախարար՝

Հ. Քուշկյան

Հավելված ՀՀ առողջապահության նախարարի 2008 թվականի մարտի 20-ի N 07-Ն հրամանի

Մ Ե Թ Ո Դ

ՊԱՐԵՆԱՅԻՆ ՀՈՒՄՔՈՒՄ ԵՎ ՍՆՆԴԱՄԹԵՐՔՈՒՄ N-ՆԻՏՐՈԶԱՄԻՆՆԵՐԻ ՊԱՐՈՒՆԱԿՈՒԹՅԱՆ ՈՐՈՇՄԱՆ

1. Կիրառման ոլորտը

Սույն մեթոդով սահմանվում է պարենային հումքում և սննդամթերքում ցնդող N-նիտրոզամինների պարունակության որոշումը ֆլուորիմետրիկ և խեմիլյումինեսցենտային միջոցով:

2. Սարքավորումներ, նյութեր, ռեակտիվներ

2.1 Տեխնիկական և անալիտիկ կշեռքներ:

2.2 Չորացնող պահարան:

2.3. Տաքացնող սարքեր (էլեկտրատաքացուցիչ, կոլբատաքացուցիչ կամ էլեկտրասալիկ):

2.4 Ռոտացիոն գոլորշացուցիչ:

2.5 Ջրային պոմպ:

2.6 Կոնտակտային ջերմաչափեր:

2.7 Լուծույթում վիտամինների ֆլուորեսցենցային անալիզի համար սարք կամ ախտորոշիչ լամպ:

2.8 Ֆլուորիմետր:

2.9 Հղկված կափարիչով խցիկ ՆՇՔ-ի (նրբաշերտ քրոմատագրում) համար, օրինակ ապակյա չորսանկյուն անոթներ 195 x 195 x 200 մմ չափերի:

2.10 Թիթեղներ ՆՇՔ-ի համար «Սիլուֆոլ» կամ «Սորբֆիլ» (առանց ֆլուրեսցենտային ինդիկատորի շերտի):

2.11 Միկրոներարկիչ 10 մկլ տարողությամբ կամ աստիճանավորված ապակյա մազանոթաբերներ (կապիլյարներ):

2.12 Մսաղաց կամ հոմոգենիզատոր:

2.13 Բունզենի շտատիվներ:

2.14 Ջրային, գլիցերինային բաղնիքներ:

2.15 Դեֆլեգմատոր եղևնաձև:

2.16 Չափիչ գլաններ 50 մլ, 100 մլ, 200 մլ տարողությամբ:

2.17 Կաթոցիկներ 1,2 մլ ծավալով:

2.18 Չափիչ կոլբեր կամ չափիչ սրվակներ 2 մլ, 5 մլ, 25 մլ, 50 մլ տարողությամբ:

2.19 Լիբիխի սառնարան ալոնժով:

2.20 Հակադարձ սառնարան:

2.21 Հարթահատակ կոլբեր 250 մլ տարողությամբ:

2.22 Կլորահատակ կոլբեր 1000, 500 և 5 մլ տարողությամբ:

2.23 Բաժանիչ ձագարներ 5 և 250 մլ տարողությամբ:

2.24 Էքսիկատոր:

2.25 Ամոնիակի ջրային լուծույթ:

2.26 Ացետոնիտրիլ, «մ»:

2.27 Բենզոլ, «մհհ»:

2.28 Թորած ջուր:

2.29 Հեքսան, «մհհ»

2.30 Կալցիումի քլորիդ` թրծված:

2.31 Բրոմաջրածնական թթու:

2.32 Աղաթթու, «քմ» և 0,1 մոլ/դմ³ ջրային լուծույթ:

2.33 Ծծմբական թթու, «քմ» և 1 մոլ/դմ³, 5 մոլ/դմ³ ջրային լուծույթներ:

2.34 Քացախաթթու սառցային, «քմ»:

2.35 Մեթիլեն քլորիդ:

2.36 Վազելինային կամ պարաֆինային յուղ:

2.37 Նատրիումի հիդրօքսիդ և 0,1 մոլ/դմ³ ջրային լուծույթ «քմ»:

2.38 Ծծմբաթթվական նատրիում` թրծված:

2.39 Ածխաթթվական նատրիում:

2.40 Նատրիումի քլորիդ:

2.41 Մեթիլ սպիրտ, «մհհ»:

2.42 Էթիլ սպիրտ:

2.43 Սուլֆամինային կամ սուլֆանիլային թթու:

2.44 Ստանդարտ և աշխատանքային լուծույթներ:

Սույն մեթոդում կիրառվում են հետևյալ հապավումները`

«մհհ»` մաքուր հետազոտության համար,

«մ»` մաքուր,

«քմ»` քիմիապես մաքուր,

C` խտություն,

R_a ` նյութի ճակատի (մեկնարկի գծից մինչև բծի կենտրոն) հարաբերությունը լուծիչների ճակատին (մեկնարկի գծից մինչև լուծիչների ճակատի գիծը),

pH` ջրածնային ցուցիչ,

ԿԱԶ` 8-մեթօքսի-5-խինոլինսուլֆոնիլազիրիդին,

8-մեթօքսի-5 (N-(2-N-դիէթիլամինո)) խինոլինսուլֆոնամիդային ամինների ածանցյալներ` դիմեթիլամինի (ԿԱԷ-ԴՄԱ); դիէթիլամինի (ԿԱԷ-ԴԷԱ); դիպրոպիլամինի (ԿԱԷ-ԴՊԱ)- սպիրտային լուծույթները C=2 մգ/մլ խտությամբ,

HBr/AcOH` Սառցային քացախաթթվում գազային բրոմաջրածնի 2-3% լուծույթ,

ՆԴՊԱ` Նիտրոզոդիպրոպիլամին (ՆԴՊԱ-հեքսանային լուծույթ) C=0,2 մգ/100 մլ խտությամբ.

ՆՏՓ` նորմատիվ տեխնիկական փաստաթուղթ:

Օգտագործվող չափման միջոցները, սարքավորումները, քիմիական նյութերն իրենց չափագրական բնութագրերով պետք է ապահովեն մեթոդի ճշտության աստիճանը:

3. Մեթոդի էությունը

3.1 N-նիտրոզամինների որոշման մեթոդը բաղկացած է հետևյալ քայլերից.

3.1.1 N-նիտրոզամինների գոլորշիով կամ վակուումով թորման ճանապարհով անջատում,

3.1.2 ջրային թորվածքից մեթիլեն քլորիդով նիտրոզամինների լուծամզում (էքստրակցիա),

3.1.3 այդ լուծամզուկի խտացում,

3.1.4 N-նիտրոզամինների դենիտրոզացում բրոմաջրածնի քացախաթթվային լուծույթով,

3.1.5 ստացված ամինների ալկիլացում 8-մեթօքսի-5-խինոլինսուլֆոնիլազիրիդինով (ԿԱԶ),

3.1.6 սիլիկագելի նուրբ շերտում ֆլուորեսցենցող 8-մեթօքսի-5-(N-(2-N-դիէթիլամինո)) խինոլինսուլֆոամիդների ածանցյալների (ԿԱԷ-ածանցյալների) բաժանում և քանակական որոշում:

N-նիտրոզամինների նույնականացումը իրականացվում է սիլիկագելի նուրբ շերտում նմուշից ֆլուորեսցենցող (ԿԱԷ) ածանցյալների և համապատասխան ստանդարտների շարժունակությունների համեմատությամբ (դիմեթիլամին` ԿԱԷ-ԴՄԱ, դիէթիլամին` ԿԱԷ-ԴԷԱ, դիպրոպիլամին` ԿԱԷ-ԴՊԱ):

Կիսաքանակական որոշման հիմքում ընկած է նմուշից ԿԱԷ-ածանցյալների հետքերի ֆլուորեսցենցիայի ինտենսիվության և ստանդարտ միացությունների հետքերի ֆլուորեցենցիայի ինտենսիվության վիզուալ համեմատությունը: Անհրաժեշտության դեպքում հնարավոր է նաև քանակական որոշումը ԿԱԷ-ածանցյալների ֆլուորեսցենցիայի մեծությունների չափման միջոցով:

N-նիտրոզամինների որոշման ներքին սահմանն է` 1 մկգ/կգ մթերքում:

4. Նմուշառում

Միջին նմուշից, որը պատրաստվում է ըստ սննդամթերքի կոնկրետ տեսակի համար գործող ՆՏՓ-ի, վերցվում է 100-300 գ կշռվածք: Վերցված նմուշները կարելի է պահել սառցախցիկում մինուս 8⁰C մինուս 18⁰C ջերմաստիճանի պայմաններում`1-ից 3 օր` կախված սննդամթերքի պիտանիության ժամկետից:

5. Անվտանգության տեխնիկայի պահանջները փորձարկումների ժամանակ

Տարածքը, որտեղ կատարվում է նիտրոզամինների որոշումը, պետք է ապահովված լինի ներհոս-արտաձիգ օդափոխությամբ:

N-նիտրոզամինների, քիմիական միացությունների և լուծիչների հետ աշխատանքը պետք է կատարել քարշիչ պահարանում, օգտագործելով սանիտարական պաշտպանության անհատական միջոցներ (ակնոցներ, ձեռնոցներ և այլն):

N-նիտրոզամինների հետ աշխատանք կատարվող լաբորատորիայում, վերջիններիս աշխատանքային սեղանին կամ գետնին թափվելու դեպքում, N-նիտրոզամինների քայքայման համար պետք է օգտագործել 2-3% բրոմաջրածնի քացախաթթվային լուծույթ:

N-նիտրոզամինների քայքայման նպատակով աշխատանքը ավարտելուց հետո տարածքը պետք է մշակել ուլտրամանուշակագույն լույսով:

N-նիտրոզամինների տեղափոխումը և պահպանումը կատարվում է ապակյա զոդված սրվակներում, որոնք փաթաթված են ասբեստային կտորով և փաթեթավորված մետաղական տարայում, որը պարաֆինապատում են: N-նիտրոզամինները պահում են հատուկ սառնարանում, հետազոտվող նմուշներից առանձին:

6. Հետազոտության նախապատրաստումը

6.1 Լուծույթների պատրաստումը

6.1.1 ԿԱԶ սրվակի պարունակությունը (1մգ/5մլ) տեղափոխում են 50 մլ տարողությամբ չափիչ կոլբի մեջ և էթիլ սպիրտով հասցնում են մինչև նիշը: Ստացվում է ԿԱԶ աշխատանքային լուծույթ 0,02 մգ/մլ խտությամբ:

6.1.2 ՆԴՊԱ-ի 2 մկգ/մլ խտությամբ ստանդարտ լուծույթը, հետազոտության ժամանակ օգտագործվում է որպես ներքին ստանդարտ:

6.1.3 ԿԱԷ-ԴՄԱ, ԿԱԷ-ԴԷԱ և ԿԱԷ-ԴՊԱ-ի ստանդարտ լուծույթներ.

ԿԱԷ-ԴՄԱ, ԿԱԷ-ԴԷԱ և ԿԱԷ-ԴՊԱ-ի լուծույթներից 2,5-ական մլ (C₁ =5մգ/5մլ խտությամբ) տեղափոխում են 25 մլ տարողությամբ չափիչ կոլբերի մեջ, էթիլ սպիրտով հասցնում մինչև նիշը և ստանում են C₂=0,1 մգ/մլ խտությամբ լուծույթներ: Ստանդարտ լուծույթների խառնուրդի ստացման համար 25 մլ տարողությամբ չափիչ կոլբի մեջ տեղափոխում են սրվակի մնացած պարունակությունը (յուրաքանչյուր ԿԱԷ ածանցյալից 2,5 մլ) և լուծույթը էթիլ սպիրտով հասցնում մինչև նիշը: Յուրաքանչյուր ստանդարտ ածանցյալի լուծույթի խտությունը այդ խառնուրդում հավասար է C₂=0,1 մգ/մլ: Ցածր խտությամբ (C₃ և C₄) ստանդարտ լուծույթի ստացման համար 25 մլ տարողությամբ չափիչ կոլբերի մեջ համապատասխանաբար լցնում են 2,5 և 1,25 մլ C₂ ստանդարտ լուծույթի և էթիլ սպիրտ ավելացնելով լուծույթները հասցնում են մինչև նիշը: Այդ խառնուրդներում յուրաքանչյուր ստանդարտի խտությունը համապատասխանաբար հավասար է C₃=10 նգ/մկլ և C₄=5 նգ/մկլ:

ԿԱԶ աշխատանքային լուծույթը (ըստ 6.1.1 կետի) և ԿԱԷ-ի ածանցյալների ստանդարտ լուծույթները պահվում են սառնարանում` հղկված խցանով մուգ տարայի մեջ, մեկ տարուց ոչ ավելի ժամկետում:

6.1.4 1% նատրիումի հիդրոկարբոնատի լուծույթ` 1գ Na-ի հիդրոկարբոնատը լցնում են 100 մլ տարողությամբ չափիչ կոլբի մեջ և թորած ջրով հասցնում մինչև նիշը:

6.1.5 Սուլֆանիլային թթվի (կամ սուլֆամինային) 2% լուծույթ.

20 գ սուլֆանիլային կամ սուլֆամինային թթուն լցնում են 100 մլ տարողությամբ չափիչ կոլբի մեջ, ավելացնում են 600-800 մլ թորած ջուր, խառնում ջրով և հասցնում մինչև նիշը:

6.2 Լուծիչների և ռեակտիվների պատրաստումը հետազոտության համար, նրանց մաքրության ստուգումը:

6.2.1 Մեթիլեն քլորիդի նախապատրաստումը:

Օգտագործման համար նախատեսված մեթիլեն քլորիդը նախօրոք ենթարկվում է աստիճանական թորման: 60-75 մլ մեթիլեն քլորիդը (քանակությունը, որը օգտագործվում է հետազոտության ժամանակ) խտացնում են մինչև 1 մլ ըստ 7.1 և խտանյութը հետազոտում են N-նիտրոզամինների պարունակության նկատմամբ ֆլուորիմետրիկ կամ խեմիլյումինեսցենտային մեթոդով համաձայն 8-րդ կետի: N-նիտրոզամինների բացակայության դեպքում մեթիլեն քլորիդը կարող է օգտագործվել N-նիտրոզամինների հայտնաբերման համար, հակառակ դեպքում` մեթիլեն քլորիդը ենթարկում են լրացուցիչ մաքրման: Դրա համար 500 մլ մեթիլեն քլորիդը կրկնակի լվանում են խիտ ծծմբական թթվի լուծույթով (H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)` 2 անգամ 30-ական մլ և թորած ջրով, այնուհետև 30% նատրիումի հիդրօքսիդի լուծույթով և նորից թորած ջրով` մինչև չեզոք pH-ի ստացումը, չորացնում են թրծված կալցիումի քլորիդով և կատարում են աստիճանական թորում, հավաքելով ֆրակցիան 40 + 0,2⁰C ջերմաստիճանային պայմաններում:

6.2.2 Ռեակտիվների մաքրության ստուգումը:

Ռեակտիվների յուրաքանչյուր խմբաքանակի նմուշները (Na₂ SO₄, NaCl, NaOH և այլն) այն քանակությամբ, որ օգտագործվում է հետազոտության ընթացքում, 10 րոպե առանձին պահում են 60-70 մլ մեթիլեն քլորիդի հետ, այնուհետև ֆիլտրում և խտացնում են ըստ 7.1 կետի մինչև 1մլ և խտանյութը հետազոտում են նիտրոզամինների առկայության նկատմամբ: N-նիտրոզամինների բացակայության դեպքում ռեագենտները օգտագործվում են ըստ նպատակի: N-նիտրոզամինների առկայության դեպքում` ենթարկվում են լրացուցիչ մաքրման վերաբյուրեղացման ճանապարհով կամ փոխարինվում են նորով:

7. N-նիտրոզամինների անջատումը

7.1 N-նիտրոզամինների անջատումը գոլորշու միջոցով թորման ճանապարհով:

50-100 գ մսաղացով մանրացված կշռանքը տեղավորում են 500 մլ տարողությամբ կլորահատակ կոլբի մեջ, որը միացված է գոլորշի ստեղծող կոլբի հետ և ուղիղ սառնարանին: Նմուշին ավելացնում են 10 գ նատրիումի քլորիդ, 10 գ նատրիումի կամ մագնեզիումի սուլֆատ, 25-50 մլ թորած ջուր (կախված մթերքի խոնավությունից), 5 մլ 2% սուլֆամինային (կամ սուլֆանիլային) թթու (ըստ 6.1.5 կետի), 5-10 մլ 1մոլ/դմ³ խտությամբ ծծմբական թթվի (H₂SO₄) լուծույթ մինչև pH=3,1 մլ ՆԴՊԱ-ի հեքսանային լուծույթ (ըստ 6.1.2 կետի) և N-նիտրոզամինները թորում են ջրային գոլորշիով, հավաքելով 200-300 մլ թորվածք: Եթե գոլորշիով թորումը ուղեկցվում է փրփրացմամբ (գարեջուր, ցորեն, հիդրոբիոնտներ և նրանցից ստացված մթերք), ապա ավելացնում են 5-10 մլ հագեցած ապիեզոնի իզոպրոպրիլ սպիրտի լուծույթ, իսկ եթե թորման ընթացքում նմուշի կտորները կպչում են իրար (հաց, ցորեն և այլն)` ավելացնում են կերամիկայի մանր փշուրներ կամ ապակյա մազանոթի կտորներ:

Ալկոհոլային ըմպելիքներից N-նիտրոզամինների առավել լրիվ անջատման համար անհրաժեշտ է նմուշը նոսրացնել ջրով մինչև սպիրտի խտությունը դառնա 20%: Թորվածքը տեղափոխում են բաժանիչ ձագարի մեջ և N-նիտրոզամինները 4-5 անգամ լուծամզում են 15 մլ թարմ թորված մեթիլեն քլորիդով:

Ծանոթություն. խորհուրդ չի տրվում այլ` ոչ բևեռային լուծիչների (եթեր, էթիլացետատ, հեքսան, քլորոֆորմ և այլն ) օգտագործումը, քանի որ ջրային լուծույթներից N-նիտրոզամինների կորզման աստիճանը շատ ցածր է:

Միացյալ քլորմեթիլենային լուծամզուկները չորացնում են թրծված մագնեզիումի սուլֆատով, ֆիլտրում են, չորացուցիչը լվանում են մեթիլեն քլորիդի ոչ մեծ ծավալով, միացյալ ֆիլտրատները տեղափոխում են 100-150 մլ կլորահատակ կոլբի մեջ, որը միացված է դեֆլեգմատորին (կամ օդային սառնարանին), տեղադրում են ջրային բաղնիքում և մեթիլեն քլորիդը գոլորշացնում են մինչև դառնա 5-7 մլ (55-65⁰C ջերմաստիճանում): Նպատակահարմար է իներտ գազի հոսանքի անցկացումը քլորմեթիլենային լուծույթի միջով: Լուծույթի ծավալը 5-7 մլ մնալուց հետո դեֆլեգմատորը հանում են, լվանում 2 մլ հեքսանով և շարունակում են նմուշի խտացումը մինչև 1-2 մլ:

7.2 N-նիտրոզամինների անջատումը վակուումային թորումով:

20-50 գ զանգվածով հետազոտվող նմուշը կշռված (0,1 գ ճշտությամբ), տեղափոխում են 200 մլ կլորահատակ կոլբի մեջ, ավելացնում են 75-80 մլ թորած ջուր, 1 մլ ՆԴՊԱ-ի հեքսանային լուծույթ, 4 մլ 0,1 մոլ/դմ³ նատրիումի հիդրօքսիդի լուծույթ և 20 մլ պարաֆինային կամ վազելինային յուղ (զանգվածի հանդարտ թորման համար) և միացնում են վակուում համակարգին:

Հետազոտվող նմուշով կոլբը տեղավորում են այրիչի վրա գտնվող ավազի բաղնիքի վրա: Ընդունող կոլբը սառեցնում են չոր սառույցի և հեքսանի (ացետոնի խառնուրդով) կամ հեղուկ ազոտով: Կատարում են թորում, համակարգում հաստատելով վակուում (մինչև 1մթն) և հավաքում 50 մլ թորվածք: N-նիտրոզամինների կորստից խուսափելու համար թորումը պետք է կատարել փակ համակարգում: Համակարգի հերմետիկությունը կարելի է պահպանել օգտագործելով մաքուր վակուումային քսուք կամ տեֆլոնային երիզներ հղկված մասերի համար: Թորման ավարտից հետո հեռացնում են տաքացուցիչը, դադարեցնում սառեցումը, անջատում են վակուում համակարգի խողովակը, հետո` թորման համակարգը և լվանում մի քանի մլ թորած ջրով, որը ավելացնում են թորվածքին: Թորվածքով կլորահատակ կոլբի մեջ ավելացնում են 1-2 մլ էթանոլ, 0,5մլ 5 մոլ/դմ³ ծծմբական թթվի լուծույթ (H₂ SO₄) և երեք անգամ լուծամզում են 7-10 մլ մեթիլեն քլորիդով: Լուծամզուկը (ներքին շերտը) չորացնում են անջուր նատրիումի սուլֆատով: Չորացումից հետո լուծամզուկի յուրաքանչյուր չափաբաժինը տեղափոխում են փորձանոթի մեջ: Բաժակի մեջ մնացած նատրիումի սուլֆատը լվանում են 2 մլ մեթիլեն քլորիդով, որն ավելացնում են լուծամզուկին: Լուծամզուկի խտացումը կատարում են ջրային բաղնիքի վրա 40⁰C ջերմաստիճանում ազոտի հոսքի տակ մինչև 5-7 մլ, այնուհետև լուծամզուկը տեղափոխում են կենտրոնախույս փորձանոթի մեջ և խտացնում ազոտի հոսքով սենյակային ջերմաստիճանում մինչև 1մլ (լուծամզուկի լրիվ թորումը բացառել):

8. Հետազոտության ընթացքը

8.1 Ալկիլացման կատարումը:

8.1.1 Դենիտրոզացում: Ըստ 7.1 կետի կամ ըստ 7.2 կետի ստացված մեթիլեն քլորիդային կամ հեքսանային լուծույթը (2 մլ) բաժանում են 2 հավասար մասերի (լուծույթ Ա և լուծույթ Բ): 1 մլ լուծույթին (լուծույթ Ա) ավելացնում են 1մլ 2-3% գազային բրոմաջրածնի քացախաթթվային լուծույթ( HBr/AcOH) (չի թույլատրվում օգտագործել բրոմաջրածնական թթու) և այդ լուծույթը 30 րոպե պահում են սենյակային ջերմաստիճանում: Ապա լուծույթը գոլորշացնում են ռոտացիոն գոլորշացուցչի վրա 40-50⁰C ջերմաստիճանի և ճնշման`p=10-15 մմ սնդիկի սյան պայմաններում, մինչև լուծիչի լրիվ հեռանալը:

8.1.2 ԿԱԷ ածանցյալների ստացումը: Ստացված չոր մնացորդին ավելացնում են 0,2-0,3 մլ նատրիումի հիդրոկարբոնատի լուծույթ (ըստ 6.1.4 կետի) մինչև խառնուրդի pH մեծ լինի 8-ից, 0,5 մլ ԿԱԶ-ի սպիրտային լուծույթ (ըստ 6.1.1 կետի), 30 րոպե եռացնում են հետադարձ սառնարանով գլիցերինային բաղնիքի վրա` 100<sup>0</sup>C ջերմաստիճանի պայմաններում: Գարեջրում և քաղցուի մեջ N-նիտրոզամինների պարունակության որոշման դեպքում ավելացնում են 2,5 մլ ԿԱԶ-ի աշխատանքային լուծույթ (ըստ 6.1.1 կետի): Խառնուրդը գոլորշացնում են մինչև չոր մնացորդի, որը լուծում են 0,3-0,5 մլ էթիլ սպիրտում: Այդ լուծույթը օգտագործում են N-նիտրոզամինների հետազոտության համար: Ստացված ամինների ԿԱԷ ածանցյալները, որոնց պարունակությունը համարժեք է նմուշում N-նիտրոզամինների քանակությանը, հետազոտում են նրբաշերտ քրոմատագրաֆիայի մեթոդով` համեմատելով ստանդարտների հետ, որոնք պատրաստված են ըստ 6.1.3 կետի:

«Զրոյական նմուշի» պատրաստման համար քլորմեթիլենային լուծամզուկի երկրորդ մասին (լուծույթ Բ) ավելացնում են 0,1 մլ ԿԱԷ աշխատանքային լուծույթ (ըստ 6.1.4 կետի) և եռացնում են 30 րոպե: Հետագա մշակումը կատարվում է լուծույթ Ա-ի նման: Ստացված սպիրտային լուծույթը (զրոյական նմուշ) հետազոտում են նրբաշերտ քրոմատագրման մեթոդով, որի արդյունքները հաշվի են առնում N-նիտրոզամինների պարունակության հաշվարկման ժամանակ:

8.1.3 Նրբաշերտ քրոմատագրում

8.1.3.1 Թիթեղի պատրաստումը քրոմատագրման հետազոտության համար:

Թիթեղը տեղադրում են քրոմատագրման համար նախատեսված խցիկում, որտեղ նախօրոք լցնում են բենզոլ-էթիլացետատ-քացախաթթու (100:50:1 հարաբերությամբ) խառնուրդը (համակարգ 1): Քրոմատագրամի զարգացումը կատարում են մինչև լուծիչը հասնի թիթեղի վերին եզրին, այնուհետև թիթեղը հանում են խցիկից, 10 րոպե չորացնում են օդում, հետո` չորացնող պահարանում, ակտիվացնում են 110-120<sup>0</sup>C ջերմաստիճանի պայմաններում` 1 ժամվա ընթացքում: Հետազոտության համար անհրաժեշտ են մի քանի թիթեղներ, որոնք ակտիվացումից հետո մինչև օգտագործումը պահում են փակ լուծամզիչի մեջ` թրծված կալցիումի քլորիդի վրա:

8.1.3.2 Նրբաշերտ քրոմատագրման իրականացումը, N-նիտրոզամինների նույնականացումը և որոշումը:

Թիթեղի ներքին եզրից 3 սմ հեռավորության վրա մատիտով նշել թույլ հորիզոնական գիծ, որի վրա 1-3 սմ հեռավորությամբ նշել 10 կետ: Առաջին կետում կաթեցնում են 20-30 մկլ հետազոտվող ԿԱԷ ածանցյալների Ա լուծույթից (ստացված ըստ 8.1.2 կետի), երկրորդ կետում` 20-30 մկլ «զրոյական լուծույթից», երրորդ և չորրորդ կետերում` համապատասխանաբար մեկական մկլ ԿԱԷ-ԴՄԱ, ԿԱԷ-ԴԷԱ C₂ խտությամբ լուծույթներից, հինգերորդ, վեցերորդ և յոթերորդ կետերում` մեկական մկլ ԿԱԷ-ԴՄԱ, ԿԱԷ-ԴԷԱ և ԿԱԷ-ԴՊԱ C<sub>3</sub> խտությամբ լուծույթներից, ութերորդ և իններորդ կետերում` կաթեցնում են համապատասխանաբար ԿԱԷ-ԴՄԱ, ԿԱԷ-ԴԷԱ C₄ խտությամբ լուծույթներից:

Թիթեղը շրջում են 180⁰ աստիճանով և տեղավորում են քրոմատագրման խցիկում (լուծիչների համակարգ առաջին): Քրոմատագրման զարգացումը կատարում են մինչև լուծիչի թիթեղի վերին եզրին հասնելը: Թիթեղը հանում են խցիկից, 15 րոպե չորացնում են օդում` քարշիչ պահարանի տակ: Կտրում են 2 սմ-ի չափով ներքևի եզրից, այդպիսով հեռացնելով լիպոֆիլ խառնուրդները:

Թիթեղը նորից են շրջում 180⁰ աստիճանով և դնում են քրոմատագրման խցիկում որտեղ լցված է ացետոնիտրիլ -25%-ամոնիակ (9:1 հարաբերությամբ) խառնուրդը (համակարգ 2): Քրոմատագրման լուծիչի մակարդակը պետք է լինի մոտավորապես կաթեցրած բծերից 1 սմ ներքև: Քրոմատագրման զարգացումը կատարում են մինչև լուծիչի թիթեղի վերին եզրին հասնելը: Թիթեղը չորացնում են օդում և նորից տեղադրում են քրոմատագրման խցիկում (լուծիչների համակարգի 1) և քրոմատագրում են նույն ուղղությամբ, չորացնում և նայում են ուլտրամանուշակագույն լույսի տակ: Համեմատելով նմուշի մեջ հայտնաբերված ֆլուորեսցող ածանցյալների շարժունակությունը ստանդարտների համապատասխան ԿԱԷ ածանցյալների շարժունակության հետ, կատարում են N-նիտրոզամինների նույնականացումը:

ԿԱԷ ածանցյալների R_f արժեքները:

Միացությունները	Rf
ԿԱԷ-ԴՄԱ	0,25
ԿԱԷ-ԴԷԱ	0,21
ԿԱԷ-ԴՊԱ	0,62

Տարբեր քանակների N-նիտրոզամինների ստանդարտների ֆլուրեսցենցիայի ինտենսիվությունը համեմատելով նմուշի և զրոյական նմուշի ֆլուրեսցենցիայի ինտենսիվության հետ որոշում են N-նիտրոզամինների քանակը նմուշի հետքում: Մթերքի նմուշում N-նիտրոզամինների պարունակությունը հաշվում են ըստ բանաձևի: Այդ դեպքում հաշվի է առնվում նմուշից (%) N-նիտրոզամինների կորզման աստիճանը` համեմատելով ներքին ստանդարտի (ՆԴՊԱ ըստ 7.1 կետի) ֆլուրեսցենցիայի ինտենսիվությունը ՆԴՊԱ-ի ստանդարտի ինտենսիվության հետ (R<sub>f</sub> -ի=0,6)`

K

=2,4×

N × V1 × 100 P × V2 × %

(մկգ/կգ)

որտեղ`

K` N-նիտրոզմանինների քանակն է պարենային հումքում և սննդամթերքում, մկգ/կգ,

N` N-նիտրոզամինների քանակն է հետքում «հաշվի առնելով զրոյական նմուշը», մկգ,

կ` մթերքի կշիռը, կգ

V1` հետազոտվող նմուշի ծավալը, մկլ

V2` կաթեցված նմուշի ծավալը, մկլ

2.4` ուղղման գործակից

%` նմուշից նիտրոզամինների կորզման աստիճանն է:

Անհրաժեշտության դեպքում սննդային հումքում և սննդամթերքում N-նիտրոզամինների քանակական որոշումը կատարում են ֆլուորիմետրով: 2 կամ ավելի թիթեղների վրա (կախված հետազոտվող լուծույթի մածուցիկությունից) թիթեղի ներքին եզրից 3 սմ հեռավորության վրա 6-7 սմ շերտով կաթեցնում են ամբողջ հետազոտվող լուծույթը (100մկլ) և այդ նույն թիթեղների վրա 3-4 սմ շերտով կաթեցնում են 100 մկլ-ական ստանդարտ լուծույթներից այն խտությամբ, որը հայտնաբերվել է նմուշում: Նմանապես կաթեցնում են «զրոյական փորձի» նմուշները:

Քրոմատագրում են ըստ 8.1.3.2 կետի: Թիթեղները չորացնում են օդում, դիտում են ուլտրամանուշակագույն լույսի տակ, ասեղով կամ մատիտով նշում են հետազոտվող լուծույթի և ստանդարտների ֆլյուրեսցող հետքերի դաշտերը տարբեր թիթեղներից, միացնում են իրար, կտրատում և տեղափոխում են 100 մլ կոլբերի մեջ, ավելացնում են 4 մլ 1 մոլ/դմ³ HCl-ի լուծույթ և պարբերաբար թափահարում են, պահում են 30 րոպե` սենյակային ջերմաստիճանում: Լուծույթը զգուշորեն լցնում են մաքուր կոլբերի մեջ (եթե առկա են սիլիկագելի մասնիկներ, նմուշները ֆիլտրում են), 3 անգամ սիլիկագելը լվանում են 1-ական 1մլ 1 մոլ/դմ³ աղաթթվի (HCl) լուծույթով և լվացուկները միացնում են հիմնական լուծույթներին: Նմանապես վարվում են նմուշի, յուրաքանչյուր ստանդարտների և «զրոյական փորձի» ֆլյուրեսցող դաշտերի հետ:

Ստացված լուծույթների (7 մլ յուրաքանչյուրը) ֆլյուրեսցենցիայի մեծությունը չափում են սպեկտրոֆլուորիմետրիկ սարքով` 340 նմ գրգռման ալիքի երկարության և 480 նմ ֆլուրեսցենցիայի ալիքի երկարության դեպքում: N-նիտրոզամինների քանակը նմուշում հաշվում են հետևյալ բանաձևով`

K

=2,4×

P × F1 × 100 M × F2 × %

(մկգ/կգ)

որտեղ՝

K` պարենային հումքում և սննդամթերքում N-նիտրոզամինների քանակն է, (մկգ/կգ),

կ` N-նիտրոզամինի քանակն է ստանդարտում, մկգ,

M` մթերքի կշռվածքն է, կգ,

Ղ1` նմուշի N-նիտրոզամինների ֆլուրեսցենցիան է, հաշվի առնելով «զրոյական փորձի» ֆլուորեսցենցիան,

Ղ2` N-նիտրոզամինային ստանդարտի ֆլուրեսցենցիան,

2,4` ուղղման գործակից,

%`- նմուշից N-նիտրոզամինների կորզման աստիճանը:

Հումքի և սննդամթերքի հետազոտությունների արդյունքների վիճակագրական մշակումը ցույց է տվել, որ հարաբերական ստանդարտ շեղումը տատանվում է 20-ից մինչև 30% (n=2, P=0.90):